在研究植物生命活动过程中,常常需要准确了解某一激素的含量,以及各激素间的比例.因此,植物内源激素的提取、分离和测定是植物生理学实验技术中极其重要的内容。本实验以ABA和GA为例,介绍激素的提取、分离及测定的基本原理和方法。
一、原理：
利用脱落酸( Absciaie acid, ABA)和赤霉素(Gibberellic acid, CA)能溶解于有机溶剂(如丙酮、甲醇)的特性进行提取,将粗提物经过一系列的分离技术(如萃I取、薄层层析或纸层析等),使ABA、GA与其他成分分离。再对纯化的ABA和GA进行生物学鉴定或物理化学鉴定。
(一)生物鉴定
(1)ABA能抑制植物器官的生长,在一定的浓度条件下,其抑制程度与浓度呈线性关系。利用这一线性关系就可确定组织中ABA的含量。
(2)GA能刺激幼嫩植物的节间伸长,特别是矮生植物的茎。在一定浓度范围内，茎的伸长度与GA浓度呈线性关系。因此,根据茎的伸长度就可确定CA的含量。
(二)物理化学鉴定
可采用气相色谱法。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
植物叶片、水稻种子及幼苗等。
(二)仪器设备
气相色谱仪,分液漏斗,组织匀浆器,旋转蒸发干燥器,层析缸,华特曼-3号层析纸，微量注射器。
(三)试剂
| (1)100%甲醇。 | (2)80%甲醇。 |
| (3)石油醚。 | (4)乙酸乙酯。 |
| (5)1 mol/L HCl。 | (6)硅酸GF232。 |
| (7)氯仿。 | (8)CA。 |
| (9)ABA。 | (10)乙醇。 |
| (11)正丁醇。 | (12)异丙醇。 |
| (13)3 mol/L氨水。 |
三、实验步骤与结果计算
(一)脱落酸和赤霉索的提取和分离
1.样品提取
(1)取新鲜材料或贮存材料(用100%甲醇固定,放置-10℃冰箱中至待测时)10g,剪碎,加人60ml预冷(＜0℃)的80%甲醇溶液,匀浆5min, 匀浆液在:4℃下振荡(或搅拌)24h,过滤。残渣再用20mI.甲醇液振荡1h。反复二次,滤液混合。
(2)将滤液在旋转蒸发器上干燥减压蒸发(36-38℃)至原体积一半，再加人10m石油醚提取部分色素,将下层甲醇液取出,弃掉石油醚层,继续咸压浓;缩至水溶液。在此水溶液中含有IAA、ABA、GA和CTK等。
2.样品萃取
将水溶液用1mol/L HCl调pH至2.8-2.5左右,并以与水溶液等体积的乙酸乙酯萃取。将混合溶液装入分液漏斗,分离水相和乙酸乙酯相。取水相再用乙酸乙酯萃取2次。合并乙酸乙醋溶液。此吋,CTK(细胞分裂素)存在于水相中,而ABA、CA、IAA存在于乙酸乙酯中。
3.样品的纯化
(1}将乙酸乙酯溶液用旋转蒸发器浓缩至干。用2mL100%甲醇溶解残留物。
(2)点祥:取100 L甲醇溶液点在涂有硅胶GF254玻板下端1 cm处(或点在华特曼3号层析纸上),并在同一水平上分别点上标准GA和ABA溶液100 μL。
(3)展层:用体积比为异丙醇:28%氨水:水(10:1:1)作为展层剂展层。前沿至玻板顶端0.5 cm处即停止展层。
(4)定位:层析完毕后，吹十玻板并在紫外灯下观察色带,与标准ABA和GA;R:值相同或相近的色带,就作为纯化后的ABA和GA。
(5)洗脱:将ABA和GA带分别括下(或前下),用95%乙醇浸提3次。溶液经减压蒸干后，即可进一步作生物学测定或气相色谱测定之用。
(二)ABA和CA的测定
1.ABA的生物学鉴定
(1)材料培养:精选小麦种子,25℃黑暗下浸种2h,排于培养皿湿滤纸上,在25℃下发芽。待胚根出现后,移入培养缸中的塑料网上,继续在25℃暗中培养。约72h后,选取胚芽鞘2.8-3.0cm的幼苗,用刀片自顶端分别切成3mm、5mm、5mm三小段,取中间5mm切段置蒸馏水中2-3h,备用。
(2)ABA母液(200:4g/m1.)的配制:称取20mg ABA,溶于少量酒精，以无离子水定容至100 mL。
(3)标准溶液的配制:吸取5 mL母液,加无离子水定容至100 mL,即为10pg/mL。吸取5mL104/mLABA溶液,用2%蔗糖-0.01mol/L磷酸缓冲液(pH5.0)定容至50mL,即为1ug/mLABA标准液。余此类推，分别配成0、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL标准液，
(4)标准曲线的绘制:取2 mL各种浓度的ABA标准液分别置入10 mL具塞试管每管加入小麦芽鞘切段10根。各浓度均需3-4个重复。加塞后，置暗处25℃摇床上振荡20h.将10个切段取出测定其总长度(cm)。然后按下列公式计算处理后减少的百分数(R):
式中：D空为空白总长度；D处理为处理总长度；D原为原始总长度（5.0cm）。用R与ABA浓度的相关性，绘制标准曲线。
(5)将待测样品溶于2mL2%蔗糖-0.01mol/L磷酸缓冲液(pH5.0),置具塞试管中，按上述步骤操作，算出R值，再查标准曲线，就得到ABA浓度C，依下式计算出样品中ABA的含量：
2.ABA的气相色谱测定
将洗脱的ABA加入0.1mL BSA(N.O-双-三甲基硅烷基乙酰胺)使脱落酸硅烷化。0.5h后，吸取5μL作气相层析，层析条件：柱长2m，Ø5mm(不锈钢柱)，固定相为10%SE-30，DMCS、A、W为担体，进样口温度250℃，柱温200℃，FID检测，载气流速为30mL/min，采用内标法定性，外标法定量。
计算：
式中:Al、As：分别代表样品和标样峰面积；Ws:标样重，μg；W:样品鲜重，g。
3.GA的生物学测定
(1)材料的准备:精选水稻种子,置饱和漂白粉液中杀菌0.5h,洗净,催芽2d。选芽长2mm左右的种子,放入加有1%琼脂的玻璃培养杯中(琼脂需经高压灭菌20 min)。每小杯内排种子10粒,注意使胚芽向上E,并偏于一边。然后，全部移人培养箱中,并保持湿度。在30℃恒温及连续光照(200 lx以上)条件下，培养2d,至第二叶叶尖伸出(苗长约0.9-1.0cm)℃剔除旺苗和弱苗后待用。
(2)GA母液(100μg/mL)的配制:10mgGA,用少量50%丙酮溶解,并用50%丙酮定容至100mL。配成1.0μg/mL、0.1μg/mL、0.001μg/mL的溶液。
(3)标准溶液的配制:吸取10 mL母液,用50%丙酮定容至100 mL,配成1.0 μg/mL ，0.1 μg/mL，0.01μg/mL的溶液。
(4)标准曲线的绘制:用10μL微量注射器各抽取1μ溶液滴在幼苗胚芽鞘与第一叶的叶腋间,然后在原光、温、湿条件下培养3d,并测定各组幼苗第二叶的叶鞘长度,从而绘出GA浓度与叶鞘长度(mm)关系的标准曲线。
(5)样品的测定:将经浓缩后的GA用2mL50%丙酮溶解,再用微量注射器吸取1μL,按上述步骤(4)操作,测出第二叶叶鞘长度(mm),从标准曲线上.查出待测物GA浓度C(μg/mL), 再以如下公式换算出样品中的GA含量。
式中:V为待测液体积,mL;w为样品鲜重,g;C为待测液浓度,μg/mL。
4.GA的气相色谱法测定
将洗脱的GA用0.1mL90%酒精溶解，加人0.1mL七氟丁酸酐,80C下保温30 min,即生成HFB-GA。然后吸取10仙溶液注人气相色谱仪,用FID检测。采用1.5%OV-1+ 1.5%OV-17作固定液,担体为Chromosorbw。柱温190℃,进样口温度250。载气流速45mL/min。用CA内标法定性,外标法定量。
式中：Al、As：分别代表样品和标样峰面积；Ws:标样重，μg；W:样品鲜重，g。