目的要求
掌握利用茚三酮显色法测定果蔬组织中游离氨基酸总量的方法。
基本原理
氨基酸(aminoacid,AA)是组成蛋白质的基本单位,也是蛋白质分解产物的种类之。游离氨基酸与果蔬品质和特殊风味的呈现有关。在果蔬的生长发育、成熟衰老过程中，游离氨基酸含量的变化与果蔬组织生理生化代谢密切相关。测定果蔬组织中游离氨基酸的含量对于研究果蔬采后生理、氮素代谢及营养状况等具有重要意义。常用茚三酮显色法测定果蔬组织中游离氨基酸总量( free amino acid content) 。
在酸性条件下,氨基酸与茚三酮共热时,能定量地生成显示蓝紫色的产物二酮茚胺，称为Ruhemans紫。该产物在波长570nm处有吸收峰,而且在一定范围内吸光度值与氨基酸浓度成正比。因此,可用分光光度计法测定其含量。
氨基酸与茚三酮的反应分两步进行。第一步,氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步,所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和一分子氨脱水缩合生成二酮茚-二酮茚胺( Ruhemans紫) ,反应式如下:
材料、仪器及试剂
(一)材料
桃、青椒、香菜、芦笋等。
(二)仪器及用具
分光光度计、研钵、水浴锅、锥形瓶、电子天平;漏斗、滤纸、具塞刻度试管(20mL)、容量瓶(50mL、100mL)、烧杯、移液器、玻璃棒.吸水纸擦镜纸、电炉、水浴锅(带铁丝筐)。
(三)试剂
1、无氨蒸馏水
在每升蒸馏水中加入2mL浓硫酸和少量高锰酸钾混合，保持紫红色,再蒸馏一次即可。
2、pH5.4乙酸-乙酸钠缓冲液
称取54.4g乙酸钠加人100mL无氨燕馏水,在电炉上加热至沸，使体积蒸发至60mL左右。冷却后转入100mL容量瓶中加30mL冰醋酸,冉用尤氨蒸馏水稀释至100mL。
3、水合茚三酮试剂
称取0.6g重结晶的茚三酮,置于烧杯中,加入15mL正丙醇,搅拌使茚二E酮溶解。再加入30mL正丁醇及60mL乙二醇，最后加入9mL pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶,置4℃下保存备用，10d 内有效。
4、标准氨基酸溶液
称取46.8mg在80℃烘干的亮氨酸(相对分子质量为131. 11) ,溶于少量10%异丙醇中，并用该溶液定容至100mL混匀。取5ml.该溶液,用蒸馏水稀释至50mL,即1mL的标准氨基酸溶液含5μg的氨基氮。
5、1g/L抗坏血酸溶液
称取50mg抗坏血酸,溶于50mL无氨蒸馏水中,随配随用。
6、10%(体积分数)乙酸溶液
量取10mL冰醋酸,用无氨蒸馏水稀释至100mL。
7、95%乙醇
实验步骤
(一)标准曲线的制作
取6支20mL具塞刻度试管,编号,按表2加入各种试剂，盖上玻璃塞,混匀。再在100℃水浴中加热15min(加热时封口),取出后立即置于冷水中迅速冷却。然后迅速向每管中加入5.0mL95%乙醇,塞好塞子,猛摇试管,使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色,此时溶液呈蓝紫色。然后用60%乙醇稀释至20mL,以0号管为参比进行调零,于波长570nm处测定溶液的吸光度值。重复三次,以氨基氮的质量为横坐标，吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,求出线性回归方程。
(二)提取
称取1.0g果蔬组织样品,置于研钵中,加入5.0mL10%乙酸溶液,研磨匀浆后,转移.到100mL容量瓶中,用蒸馏水稀释、定容至刻度,混匀。然后用干滤纸过滤到三角瓶中备用。
(三)测定
吸取1.0mL样品滤液,置于20mL干燥具塞刻度试管中,加入1.0mL无氨蒸馏水。其它操作步骤与制作标准曲线方法相同。重复三次。
实验结果与计算
1.测定数据记录
2.计算结果
根据显色液的吸光度值,在标准曲线上查出相应的氨基氮质量。果蔬组织中游离氨基酸总量以每100g果蔬(鲜重)中氨态氮的质量表示，即mg/100g。计算公式:
式中 m'——从标准曲线查得的氨基酸(亮氨酸)的质量,μg;
V——样品提取液总体积，mL;
Vs——测定时所取样品提取液体积，mL;
m——样品质量,g。
注意事项
(1)合格的茚三酮应该是微黃色结晶,若保管不当，颜色加深或变成微红色,必须重结晶后方可使用。其方法如下:将5g茚三酮溶于15mL热蒸馏水中,加入0.25g活性炭，轻轻摇动,溶液太稠时,可适量加水,30min后用滤纸过滤,滤液置冰箱中过夜后即可见微黄色结晶析出,用干滤纸过滤,再用1mL蒸馏水洗结晶一次,置于干燥器中干燥后贮于棕色瓶中。
(2)茚三酮与氨基酸反应所生成的Ruhemans紫在未加入乙醇前不稳定,故显色反应完毕冷却时应尽快加入95%乙醇稀释。
(3)茚三酮试剂主要是多肽和氨基酸的显色剂,反应在1h内稳定。试剂溶液pH以5~7为宜。
(4)空气中的氧干扰显色反应的第一步。 以抗坏血酸为还原剂,可提高反应的灵敏度,并使颜色稳定。但由于抗坏血酸也可与茚三酮反应,使溶液颜色过深,故应严格掌握抗坏血酸的加入量。
(5)实验用水及试剂应严格防止氨的污染。
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