1.原理

    硝酸还原酶是植物氮素同化的关键酶,也是一种诱导酶，与作物吸收和利用氮肥有关,可催化硝酸盐还原为亚硝酸盐:

    产生的NO₂^-在酸性条件下可以与对氨基苯磺酸(sulfanilic acid)或磺胺(对氨基苯磺酰胺,sulfanil-amide)反应生成重氮盐,再与α-萘胺反应生成红色偶氮化合物(对苯磺酸偶氮-α-萘胺)。

    生成的红色偶氮化合物在520 nm波长下有最大吸收值,可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可以每小时每克鲜重产生的NO₂^- μg 数表示酶活性(NO₂^- μg·g^-1FW·h^-1)。

    根据材料处理不同可分为活体法与离体法,根据反应介质的不同则可分为内源基质法和外源基质法。活体法步骤简单,适合快速、多组测定。离体法复杂,但重复性较好。内源基质法测定结果可反映硝酸还原酶在实际生长条件下的还原力，而外源基质法测定结果则可反映硝酸还原酶的潜在或最高还原力。下面介绍活体法的具体实验步骤。

2.试剂

(1).0.1 mol·L^-1 pH7.5磷酸缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O取30.0905g与Na₂HPO₄·2H₂O取2.4965g，用蒸馏水定容至1000 mL。
(2).30%的三氯乙酸：30g三氯乙酸，蒸馏水溶后定容至100mL。
(3).0.2 mol·L^-1 KNO₃：20.22g KNO₃用蒸馏水定容至1000 mL。
(4).磺胺试剂：1g 磺胺，加25mL 浓盐酸，用蒸馏水定容至100mL。
(5).α-萘胺试剂：0.2g α-萘胺，用含1 mL浓盐酸的蒸馏水定容至100mL。
(6).5 μg·mL^-1 NO₂^-1标准液：0.10g NaNO₂用蒸馏水定容至100mL，吸取7.5mL，再用蒸馏水定容至1000mL。

3.材料

欲测植物材料（如叶菜类蔬菜，实验材料在实验前一天可用硝态氮肥处理，以增强硝酸还原酶活性）。

3.方法步骤

（1）标准曲线制作：取7支15mL 刻度试管，按下表顺序添加试剂。

试管编号	1	2	3	4	5	6	7
5 μg·mL-1 NO2-1标准液/mL	0	0.2	0.4	0.8	1.2	1.6	2.0
蒸馏水/mL	2.0	1.8	1.6	1.2	0.8	0.4	0.0
每个试管中NO2-1含量/（μg·mL-1）	0	0.5	1.0	2.0	3.0	4.0	5.0
磺胺及α-萘胺	每管加磺胺试剂2mL，α-萘胺试剂2mL，然后静置30min
520 nm比色，吸光度（A）
回归曲线

（2）取新鲜植物组织洗净，拭干。如果是叶片可去主脉，打成直径1cm的圆片，若是根、茎可切成0.1cm厚的薄片。
（3）取上述材料4份，每份50片，称重后分别放入4个50mL三角瓶中，其中1个为空白，3个用于酶活性测定，分别记为重复1、2、3。
（4）在空白瓶中先加1mL 30%三氯乙酸，然后在每个三角瓶中加入0.1 mol·L^-1 pH 7.5 磷酸缓冲液5mL、蒸馏水5mL（内源基质法）。如果是外源基质法，则将蒸馏水换为5mL 0.2 mol·L^-1 KNO3。
（5）将三角瓶置于真空干燥器中抽气至样品完全沉入溶液中（约10min）。
（6）取出三角瓶，30℃避光30min；之后在重复中也分别加入1mL 30%的三氯乙酸以终止反应，摇匀。
（7）吸取2mL（若反应液浓度太大，可吸取1mL 加 1mL水）反应液于10mL试管中，加磺胺试剂2mL，α-萘胺试剂2mL，静置30min；比色，记下吸光度（A）；

	实验结果
	空白	重复1	重复2	重复3
鲜重
吸光度（A）
NO2-含量C/（μg·mL-1）
酶活性/（μg NO2-·g-1 FW·h-1）
平均值

4.结果计算

从标准曲线中检出NO₂^-含量（μg·mL^-1），以每小时每克鲜重产生的NO₂^-·μg数表示酶活性，计算方法：

式中，C：根据回归曲线计算的NO₂^- μg数；Vt：反应液总体积（mL）；Vs：测定时取样体积（mL）；FW：鲜重（g）；t：反应时间（h）。计算时，先分别计算3个重复的结果，再算平均值，为所求结果。