本文介绍了植物体内硝酸还原酶离体法测定的方法，硝酸还原酶是植物体内氮素同化的关键酶。本实验详细介绍了硝酸还原酶的离体法的测定方法、基本原理和实验步骤。

      硝酸还原晦(nitratereductase,NR),是植物氮素同化的关键酶,它催化植物体内的硝酸盐还原亚硝酸盐。产生的亚硝酸盐与対-氨基苯磺酸(或対-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯二胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下:

      生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收锋,可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以N ug/(g•h)为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单,适合抉速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。

离体法

一、材料、仪器设备及试剂

(一)材料

      水稻、小麦叶片、幼穗等。

(二)仪器设备

      冷冻离心机,分光光度计，天平(感量0.1 mg),冰箱,恒温水浴。研钵,剪刀,离心管,具塞试管,移液管,洗耳球。

(三)试剂

      (1)亚硝酸钠标准溶液。准确称取分析纯NaNO₂ 0.9857g溶于无离子水后定容至1000mL,然后再吸取5mL定容至1000mL,即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。

      (2)0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液。Na₂HPO₄•12H₂O 30.0905g与NaH₂ PO₄ •2H₂O 2.4965 g加无离子水溶解后定容至1 000 mL。

      (3)1%磺胺溶液。1.0g磺胺溶于100mL3mo/LHCl巾(25mL浓盐酸加水定容至100 mL即为3 mol/L HCI).

      (4) 0.02%萘基乙烯胺溶液。0.0200 g萘基乙烯胺溶于100 mL无离子水中，贮于棕色瓶中。

      (5) 0.1 mol/L KNO₃溶液。2.5275 g KNO₃溶于250 mL0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液。

      (6) 0.025 mol/I pH8.7的磷酸缓冲液。8.8640 g Na₂HPO₄•12H₂O,0.0570 g K₂HPO₄3H₂O溶于1 000 mL无离子水中。

      (7)提取缓冲液。0.1211 g半胱氨酸.0.0372 g EDTA溶于100 mL 0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液中。

      (8)2mg/mL NADH溶液。2mg NADH溶于1mL 0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液中(临用前配制)。

二、实验步骤

(一)标准曲线制作

      取7支洁净烘干的15 mL刻度试管按表1顺序加入试剂，配成0~2.0陪的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min,然后在540nm下比色测定。以亚硝态氯(μg)为横坐标(x),吸光度值为纵坐标(y)建立回归方程。

2.酶的反应

       取粗酶液0.4 mL于10 mL试管中,加入1.2 mL0.1 mol/L KNO3磷酸缓冲液和0.4mLNADH溶液,混匀,在25℃水浴中保温30min,对照不加NADH溶液，而以0.4 mL0.1 mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替。

3.终止反应和比色测定

      保温结束后立即加人1mL磺胺溶液终止酶反应,再加1mL萘基乙烯胺溶液,显色15 min后于4 000 r/min下离心5 min,取上清液在540 nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量（ug）。

表1 配制标准溶液时的各物质加入量
试剂/mL	管号
	1	2	3	4	5	6	7
亚酸硝钠标准液/mL	0	0.2	0.4	0.8	1.2	1.6	2.0
蒸馏水/mL	2.0	1.8	1.6	1.2	0.8	0.4	0.0
1%磺胺/mL	4	4	4	4	4	4	4
0.02%萘基乙烯胺/mL	4	4	4	4	4	4	4
每管含亚硝态氮/ug	0	0.2	0.4	0.8	1.2	1.6	2.0

三、结果计算

      式中:x为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量,ug; V₁为提取酶时加人的缓冲液体积,mL; V₂为酶反应时加人的粗酶液体积,mL; W为样品鲜重,g;t为反应时间,h。

 

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