通过测定伤流液中的各营养物质的含量，可以反映植物根的吸收能力和合成能力。这些营养物质包括硝态氮、氨基酸与酰胺、无机磷、K+等，本文将会介绍纸层析法鉴定伤流液中氨基酸与酰胺的含量，评价根系的代谢活性。

    根不但是水分和矿质营养的吸收器官,而且还是重要的合成器官,根系吸收的无机盐,有一部分在根中即进行初级同化,转变成有机物并向地上部运输。根的吸收与同化能力越强，向地上部输送的营养物质数量越多,有机物占的比例越大。因此,测定伤流液中各种营养物质的数量，可以评价根的吸收能力与合成能力。在一般情况下,可以测定伤流液中的硝态氮、氨基酸与酰胺无机磷、K+等。本实验的主要目的是学习伤流液中主要化学成分的分析技术,评价根系的代谢活性。

纸层析法鉴定伤流液中氨基酸与酰胺：

原理

     纸层析是利用各种物质在流动相和固定相中分配系数不同,将各种物质分离开的-种方法。所谓分配系数(a)是指一种物质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时,该物质在两种溶剂中的浓度比。

     纸层析以滤纸作为支持物,而与滤纸纤维素分子结合的水作为固定相,有机溶剂为流动相。当流动相流经样点时,样点，上的溶质依本身的分配系数在两相中进行分配,一部分溶质离开样点随有机溶剂进人无溶质区,此时溶质又进行重新分配,一-部分物质从有机相进人水相,当有机相不断向前移动时,溶质不断地进行分配。各种物质因分配系数不同,移动速率不同，使各种物质分布在滤纸不同部位。图谱上的位置常用R;值表示:

     R;值主要决定于物质的分配系数,固定相及流动相体积比,以及实验的其他条件。在相同实验条件下,两相体积比不变,R;值主要决定于物质的分配系数。物质不同,分配系数不同,R;值不同。据此将各种氨基酸分开。

仪器设备

1.微量吸管或自制毛细玻璃管。
2.容积法测定伤流量全套设备。
3.色层分析箱或色层分析缸:1个。
4.医用喉头喷雾器或玻璃喷雾器:1个。
5.色层分析滤纸:1张。
6.白棉线、曲别针。

试剂

1.冰醋酸。
2.正丁醇。
3.95%乙醇。
4. 0.1%水合茚三酮酒精溶液:0.1g水合茚三酮溶于100mL 95%乙醇中即成。
5.推动剂:按正丁醇:冰醋酸:95%乙醇:水=4:1:1:2的比例配制。

材料

    田间或盆栽的生长健壮的玉米或向日葵植株,春季实验可用刚开始萌发的葡萄植株。

方法步骤

    1.伤流液的收集:参见实验18。
    2.点样:取质地均匀细致、杂质少的层析滤纸(- -般可用新华- -号),裁成长25 cm、宽5 cm的纸条,在一.端离纸边2~3cm处用铅笔轻轻划--横线,然后用微量吸管吸取伤流液在铅笔线的适当位置上点一点,另用已知氨基酸混合液在距伤流液样点2~3 cm处点一点,作为参比。点的直径不超过0. 5 cm,每点一点要用电吹风吹干(温度不能超过80 C)方可再点一次,以免样点扩散过大,影响分离效果。若直接用未加浓缩的伤流液,需要滴20~30次,总量为30~40 μL左右。进行多个样品分析时,为了节约点样时间,可将伤流液在低温(80 C左右)下减压浓缩,根据浓缩倍数适当减少点滴次数。
    3.展开:本实验采用单向上行展开法。选择适当大小的玻璃标本缸一个,底上放一个培养皿,皿内盛放推动剂,缸盖上钻一小孔,将点好样的滤纸用曲别针和棉线通过小孔挂人缸内,滤纸下端暂勿与溶剂接触。用软木塞将小孔塞紧,滤纸便悬在缸内,用凡士林或橡皮泥密封缸盖，经12~24 h, 使滤纸与溶剂蒸汽达到平衡,松开软木塞将棉线下移，使滤纸下端浸人溶剂中,切勿将样点浸人溶剂,以免浸脱样品。此时溶剂即沿滤纸上升,待溶剂前沿距滤纸上端1~2 cm时取出,用铅笔画下前沿的位置,并将滤纸风干或在60。C的烘箱中烘干，至无明显的溶剂气味时为止。
     4.显色:滤纸干后,用喉头喷雾器在滤纸上均匀地喷上一层O.1%水合茚三酮乙醇溶液,略湿即可(显色剂过多易使色点扩展或将样品冲散),在60~80。C烘箱中加热10min,有氨基酸处即呈现出紫色斑点,用铅笔把各点轮廓画出,测量各点中心与起始线的距离,计算各点的R;值，并与标准样品中已知氨基酸的R:值相对照,即可确定伤流液中氨基酸的种类,根据各色点的大小与颜色深浅,也可粗略知道各种氨基酸含量的大小。

注意事项

     1.纸上层析操作必须十分注意洁净,尤应避免直接用手触层析滤纸,以免手上的汗渍(内含氨基酸)将纸污染并显出颜色;勿用口吹滤纸,避免唾液污染。

    2.进行纸上色层分析时,为了将各种成分分离清楚,应做到:①样点要尽可能小;②除了进行单向推动外,还可以进行双向推动;③进行氨基酸的双向推动时,常常在--个方向采用酸性溶剂系统,而在另-方向采用碱性溶剂系统。

 

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