原理

     Folin-酚试剂法（福林-酚试剂法）结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸和磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。在650nm比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适用于微量蛋白的测定（氛围为5-100μg蛋白质）。

仪器设备

1.722分光光度计。	2.定量滤纸。
3.恒温水浴。	4.定量加样器。
5.冷凝回流装置一套。	6.研钵一套。
7.漏斗。	8.刻度移液管。
9.微量滴定管。	10.试管。

 

试剂

1.Folin-酚试剂：由甲、乙两种溶液组成。

甲液：由A、B两种溶液组成。

A液：4%碳酸钠（Na₂CO3）溶液与0.2mol•L^-1氢氧化钠（NaOH）溶液等体积混合；

B液：1%硫酸铜（CuSO₄•5H₂O）溶液与2%酒石酸钾钠溶液等体积混合。

每次使用前将A液与B液按50：1的比例混合即成，此试剂只能使用1d，过期失效。

乙液：称取钨酸钠（Na₂WO₄•2H₂O）100g，钼酸钠（Na₂MoO₄•2H₂O）25g，加蒸馏水700mL溶解于1500mL的圆底烧瓶中。之后加入85%的H₃PO₄50mL，浓HCI100mL，安上回流装置（使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡纸包起来），使慢慢沸腾10h。冷却后加入硫酸锂（Li₂SO₄•H₂O）150g,蒸馏水50mL，溴水2-3滴打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴。待冷却后稀释至1000mL，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存（冷却后溶液呈黄色，若仍呈绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。此为Folin-酚试剂乙液，其最终使用浓度相当于1mol•L^-1 H⁺酸。因此在使用前应进行标定。标定方法：取5mL Folin-酚试剂乙液放入锥形瓶内，用1mol•L^-1标准NaOH溶液滴定，酚酞作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点。计算其相当的酸度，用稀盐酸或稀氢氧化钠溶液调至相当于1mol•L^-1 H⁺酸度。

2.标准蛋白质溶液：称取25mg牛血清清蛋白，溶于100mL蒸馏水中，使终浓度为250μg•mL^-1。

3.0.1mol•L^-1磷酸缓冲液（pH7.0）。

材料

     各种植物材料。

方法步骤

    1.标准曲线的绘制

    （1）取18mmX200mm试管7支，1-7编号，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1mL，使每管含蛋白量分别为0、25、50、100、150、200、250μg•mL^-1。

    （2）用定量加样器给每支试管中加入5mL甲液，混匀，于30℃下放置10min。

    （3）再向试管中喷射加入0.5mL乙液，立即振荡混匀，在30℃下准确保温30min。

    （4）以不加标准蛋白的1号管为空白，在650nm下用1cm光径的比色杯测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或求回归方程。

    2.样品的测定：称取鲜样0.8g，用5mL蒸馏水或pH7.0磷酸缓冲液研磨成匀浆后，定容25mL过滤，取滤液1.0mL于试管中，然后重复标准曲线绘制中的2-4步骤，以空白管凋零，测定吸光度。根据吸光度查标准曲线或按回归方程计算，求出样品中的蛋白质含量。

    3.结果计算

式中，C：查标准曲线值（vg）;Vt:提取液总体积（mL）；Vs:测定时加样量（mL）;FW:样品鲜重（g）;1000:将μg换算成mg。

注意事项

1.还原物质、其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
2.因为Folin-酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在pH=10.0的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏钱即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。

 

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