目的

     分离植物基因组DNA是建立基因组文库、遗传标记作图及基因克隆的前提。不同的下游操作,对所提取DNA的量、纯度、完整性的要求也不同。在实验中,应根据实验目的，采用快速、简便、安全的方法,对基因组DNA进行提取和鉴定。

原理

     将植物组织在液氮中研磨以破碎细胞壁。采用一定pH、通常含有去垢剂、EDTA的裂解液在破坏细胞膜的同时将DNA抽提至水相,得到DNA的粗提液。再根据不同植物材料的成分特点,采取各种方法抽提,去除杂质,最后用一定的沉淀剂将DNA沉淀出来。

此处介绍用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)快速提取植物组织DNA的方法。CTAB是一种阳离子去污剂,可以裂解细胞并释放出DNA。再经氯仿-异戊醇抽提,去除蛋白杂质,即可得到适合于分子操作的DNA。

仪器设备

1. 分析天平。
2. 恒温水浴。
3.冷冻高速离心机。
4.1000μL微量进样器及一次性枪头。
5.预冷的研钵。
6.50mL离心管。

试剂

    1.液氮。
    2.氯仿-异戊醇：24：1（体积比）。
    3.CTAB分离缓冲液：100mmol•L^-1 Tris-HCI，pH8.0内含2%CTBA（质量浓度），1.4mol•L^-1 NaC1，20mmol•L^-1 EDTA。配置后温室避光贮存，用前加入0.2%（体积分数）β-疏基乙醇。
    4.洗涤缓冲液:76%乙醇、10 mmol•L^-1乙醇胺共100mL。
    5.TE缓冲液:10 mmol•L^-1 Tris-HCl,1 mmol•L^-1 EDTA,pH 8.0。
    6.异丙醇。

材料

     黄化或幼嫩植物叶片。

方法步骤

     1.称取1.0-1.5g新鲜植物材料,置于预冷的研钵内,加入液氮研磨成粉末。

     2.加入10-15 mL预热至60°C的CTAB分离缓冲液,混合成为匀浆,转移至50mL离心管。

     3.60°C水浴保温30 min。

     4.加入等体积的氯仿-异戊醇,轻轻颠倒混匀。

     5.4°C 10000g离心10min,用加样枪吸出水相,同时量取体积。

     6.加人2/3体积预冷的异丙醇,轻轻转动离心管,即可观察到DNA沉淀。

     7.依步骤5再离心一次,小心弃去上清,用10-20 mL洗涤缓冲液反复洗涤沉淀3次。

     8.将DNA沉淀溶于1mL TE缓冲液中,进行纯度测定。

注意事项

     1.DNA分子容易受机械力作用而断裂成小片段,所以各步操作均应尽可能温和,尤其避免剧烈振荡。

    2.最适条件下,提取的DNA呈白色纤维状,可用适当工具从溶液中钩出。富含多糖的组织会使DNA呈胶状,极难溶解。可将植株采样前暗培养24 h以达到除去多糖的目的。如果提取的DNA呈褐色,说明有酚类物质污染,可在CTAB分离缓冲液中添加2%(质量浓度)的PVP(聚乙烯吡咯烷酮,相对分子质量10000)。

 

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