一、原理：

    植物细胞中的RNA包括rRNA、tRNA和mRNA。rRNA是含量最丰富的，占植物总RNA量的70%。tRNA在细胞中的含量也比较丰富，占15%。mRNA的含量较低，其大小、序列各异，长度从几百bp到几千bp不等，是基因转录、加工后的产物，反应了植物组织在某一时间点上的基因转录情况。纯化完整的RNA是进行基因表达研究和从cDNA文库克隆新基因的基础。

    因为核糖残基在2′和3′位带有羟基，所以RNA比DNA的化学性质更活泼，易于被RNA酶所降解。RNA酶是一种耐受性很强的酶，可抵抗长时间煮沸和温和变性剂，也不会被溶液中的金属螯合剂所失活。裂解后的植物细胞会释放出RNA酶，人的皮肤也是含有大量RNA酶。实验中使用的玻璃器皿、缓冲液，甚至操作台面和浮尘中都可能含有RNA酶。目前尚无使RNA酶失活的简易方法。所以，实验的每一步操作都应注意避免被RNA酶所污染。

二、仪器设备

1.灭菌锅。	2.通风橱。
3.冷冻离心机。	4.1.5mL离心管。
5.恒温水浴。	6.微量进样器及一次性枪头。
7.烘箱。	8.分析天平。
9.pH计。	10.一次性手套。
11.预冷的研钵。

三、试剂

    1.双蒸水。
    2.液氮。
    3.1mol•L^-1 NaAc。
    4.提取缓冲液：50mmol•L^-1 Tris-HCI，pH8.0，含10mmol•L^-1 EDTA、0.5%SDS、100mmol•L^-1 NaCI、4mol•L^-1异硫氰酸胍、100mmol•L^-1β-疏基乙醇(用前加入)。
    5.水饱和酚：氯仿：异戊醇=24:24:1（现用现配），pH8.0。
    6.氯仿：异戊醇=24:1。
    7.无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇。
    8.1:500（体积比）DEPC(焦炭酸二乙酯)。

溶液3和7配制时需加入1:500（体积比）EDPC后定容，在通风橱中放置2h，高压灭菌30min。用同样方法处理一定量双蒸水，用于清洗。含Tris的缓冲液用灭菌的双蒸水配制。

四、材料

小麦幼苗。

五、方法步骤

     1.实验准备：将所有玻璃器皿于180℃下干烤4h;所有离心管、枪头用0.1%DEPC(焦炭酸二乙酯)浸泡2h,再用灭菌的双蒸水（SDW）冲洗，最后高压灭菌30min。
    2.将新鲜小麦幼苗置研钵中，加入液氮研成细粉。加提取缓冲液浸提5min。每1.5mL离心管的适宜用量为0.2g材料，1.2mL提取缓冲液。
    3.12000g，4℃离心15min（以下离心操作均同此步）。
    4.加入1X体积的酚/氯仿/异戊醇振荡萃取，离心。
    5.取上清液，用1X体积的氯仿/异戊醇重复萃取、离心一次。如两相界面上仍有蛋白等杂质，则重复此步骤，直至界面清晰为止。
    6.用加样枪吸取上清转移至另一离心管中，同时量取体积。加1mol•L^-1NaAc至终浓度为0.14mmol•L^-1,混匀，加0.7X体积无水乙醇，4℃放置，可见白色RNA絮状沉淀。
    7.离心，用70%乙醇沉淀几次，每管用30-50μL双蒸水重悬浮沉淀用于检测。

六、注意事项

    1.人的唾液、汗液、皮肤表面有RNA酶，实验过程中要使用一次性手套。
    2.使用DEPC时必须戴口罩、手套，并在通风橱内进行。严禁DEPC接触皮肤。
    3.如果提取出的RNA经检测有DNA污染，可以加入DNA酶进行处理。
    4.本方法仅适用于幼嫩植物组织，不适用于淀粉含量高或次生物质含量高的植物材料。

 

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