在正常环境条件下生长的植物，体内游离脯氨酸的含量较低；但在逆境，如干旱、寒害、热害、盐碱胁迫等条件下，植物体内游离脯氨酸（proline，Pro）的含量可显著增加。脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质体及组织内的代谢过程。因此，有人提出游离脯氨酸的含量作为植物抗逆性的指标。本实验要求掌握脯氨酸标准曲线的制作，植物体内游离脯氨酸提取及含量测定的方法，了解植物在逆境下脯氨酸含量的变化规律 。

原理

    植物体内的游离脯氨酸可以用磺基水杨酸或酒精提取。在酸性条件下，脯氨酸可与茚三酮加热后反应生成稳定的红色产物（此红色产物有互变异构体，其结构如下），520nm波长是其最大吸收峰。产物用甲苯萃取后，在该波长下，A值（吸光度）与溶液中红色产物的含量成正比。因此可以通过标准曲线查出或用回归方程计算出样品脯氨酸的含量。

试剂

(1).酸性茚三酮：称取2.5g茚三酮，加入60mL冰醋酸和40mL 2mol·L^-1 H₃PO₄,于70℃下加热溶解，冷却后贮于棕色试剂瓶中备用，4℃下2-3d内有效。
(2).脯氨酸标准溶液：称取0.025g脯氨酸，溶解在250mL蒸馏水中，其浓度为100μg·mL^-1。再取此液10mL，用蒸馏水稀释至100mL，即为10μg·mL^-1之脯氨酸标准液。
(3).冰醋酸。
(4).甲苯。
(5).3%的磺基水杨酸溶液。

方法步骤

(1).标准曲线的制作：取7支25mL具塞试管，编号。按下表向各试管加入试剂，摇匀后，沸水浴30min，冷却，各加5.0mL甲苯，充分摇匀萃取。避光静置2-3h。待完全分层后，用吸管吸取甲苯层，用分光光度计以1号标准曲线试管作为空白调零，在520nm波长下测定吸光度。以脯氨酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。同时可以使用回归法求得回归直线。

试剂	标准曲线
	1	2	3	4	5	6	7
标准Pro/mL	0.0	0.2	0.4	0.8	1.2	1.6	2.0
水/mL	2.0	1.8	1.6	1.2	0.8	0.4	0.0
冰乙酸/mL	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
茚三酮/mL	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
Pro含量/（μg·mL-1）	0	2	4	8	12	16	20
A520

（2）样品游离脯氨酸提取：植物体内的游离氨基酸可以用80%的乙醇或3%磺基水杨酸提取。
①酒精提取:取正常供水及干旱条件下小麦功能叶片，装入塑料袋内，迅速带回实验室。称取0.1〜1.01 g新鲜样品两份，一份烘干测干重，另一份用于脯氨酸测定，样品放入研钵中，加入80%的乙醇及少许石英砂，研成匀浆，移入具塞试管中，加塞浸提1 h以上，然后按0.25:10 (质量浓度）的比例加入活性炭粉末，震荡后过滤于蒸发皿内，用80%的乙醇冲洗试管和残渣3 次。滤液于 80〜85℃水浴中蒸去乙醇，残液用蒸馏水定容至50 mL（或25 mL，以脯氨酸的含量而定）。取提取液10 mL于具塞试管中，加入1 g人造沸石强烈震荡，然后滤去人造沸石（碱性氨基酸对脯氨酸测定有干扰，被人造沸石吸附而除去）。滤液待测。
②磺基水杨酸提取：采样和称样与酒精相同。将称好的样品放入具塞试管中，加入5 mL 3%的磺基水杨酸溶液，加盖，将试管浸入沸水浴中提取15 min过滤，滤液待测。

（3）样品的测定：每个样品滤液设3个重复，在试管中加滤液0.5 mL,水1.5 mL,其后各加入冰乙酸2.0 mL和茚三酮2.0 mL，摇匀后沸水浴30 min,冷却，各加5.0 mL甲苯，充分摇匀萃取（暗中静置 2〜3 h)。

试剂	正常供水			干旱胁迫
	1	2	3	1	2	3
滤液/mL	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
水/mL	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
冰乙酸/mL	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
茚三酮/mL	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
A520
Pro含量/（μg·mL-1）

结果计算

测定结果按下式计算：

    式中，C：从标准曲线上查得的（或计算的）脯氨酸重量（μg）；V_t：提取液总体积（mL）；V_s：测定时取用提取液体积（mL）；W：样品干重（g）；10⁶：将g换算为μg。

注意事项

(1).一般样品在胁迫24h即已表现脯氨酸含量显著增加，处理时间越长，则效果愈加显著。所以取样量应当随处理时间延长而减少，否则样品吸光值会超出标准曲线。
(2).配置的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定，因此必须现用现配；制作标准曲线的脯氨酸标准液也应当现用现配，不可将母液放置到4d后使用。