本文介绍了植物种子中主要不饱和脂肪酸的分离的测定方法，包括不饱和脂肪酸的分离测定的原理，实验所需试剂，实验步骤以及实验注意事项。

原理：

      在纸层析中，通常支持相是含水的，移动相是有机溶剂。但是脂肪酸( fattyacid)等化合物宜用有机溶剂为支持相，而以含水溶剂为移动相,这样能更好地进行分配，也就是所谓“反相纸层析法”。由于木同的脂肪酸在两相中分配系数不同,所以在层析滤纸上移动速率就有差异,这样就使混合脂肪酸各组分被分开，然后用醋酸铜处理,将脂肪酸转化为相应的铜盐,再用红氨酸显色,即可得到蓝灰色点状层析图谱。

材料、仪器设备及试剂

(一)材料

      油菜籽。

(二)仪器设备

      层析纸，层析缸，层析架，显色盘，烘箱或电吹风，微量进样器。

(三)试剂

      (1) 5%KOH-CH₃OH溶液:称5g KOH溶于100 mL CH₃OH中。

      (2) 10%液体石蜡-石油醚溶液:量取10 mL液体石蜡,用石油醚稀释至100 mL。

      (3) 95%醋酸溶液。(4)1%醋酸铜溶液。

      (5) 0. 03%红氨酸(二硫代草酰胺)溶液:称150 mg红氨酸,溶于500 mL95%乙醇中。

      (6) 1mol/LHCI:取浓HCL134mL加水到400mL。

      (7) 石油醚:沸程为30-60℃。

三、实验步骤

(一)样品制备

      切样:将一粒干燥的油菜种子,用刀片沿着与脐平行的方向切下外子叶一部分(注意不要损伤胚),装人小指管中(或用有穴白瓷板代替),也可采用整粒种子。

      酯化:向盛有样品的小试管中加入0.1mI.(2滴)KOH-CH₃OH溶液,并将样品用玻棒研碎,然后放置6-8h。加入0.15 mL(2~3滴)1 mol/L HCI及0.1 mL(2滴)石油醚。

(二)点样

      在层析纸一.边用铅笔轻轻划一直线,每隔1.5 cm用铅笔轻轻点一记号,编号。

      将层析纸放人石蜡油溶液中浸泡,取出晾干(使编号向上)。

      在层析纸各编号处,用针刺一小孔,然后用毛细管取样品.上清液0.01 mL,按编号顺序滴入孔洞处(每次取样后,用石油醚洗微量进样器的针头)。

(三)展开溶剂系统与条件

      将点好样的层析纸固定在层析架上(使编号朝下),放人盛有醋酸溶液的层析缸中,醋酸溶液的多少以能浸泡层析纸但液面低于点样处为宜。至展层剂上升到距滤纸顶端1 cm处为止,取出层析纸,晾干。

(四)显色

      将层析纸浸入醋酸铜溶液中,使其生成脂肪酸铜盐。用清水稍许冲洗,再放人洁净的瓷盘中,用流水漂洗0.5h左右。

      将层析纸小心取出,用干毛巾或滤纸吸干大部分水分后，置于40℃烘箱中千燥。

      将层析纸在红氨酸溶液中一带而过,与脂肪酸铜盐作用立即显出蓝灰色的斑点。

结果分析

      绘出反相纸层析色谱.上五种不饱和脂肪酸的位置的示意图。

[附注]油菜籽中不饱和脂肪酸在反相纸层析图谱中的顺序由下而上为:芥酸、花生烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸。