原理：

      斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应,其中包括两步反应:第一步是在碱性条件下,与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物;第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原,生成磷钥蓝和磷钨蓝的深监色混合物,颜色深浅与蛋白含量成正相关。在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。由于肽键显色效果增强,从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适于微量蛋白的测定(范围为5-100ug蛋白质)。

材料、仪器设备及试剂

(一)材料

      各种植物材料。

(二)仪器设备

      722分光光度计,离心机,恒温水浴,定量加样器,冷凝回流装置一套,研钵，离心管,刻度移液管,微量滴定管,试管等。

(三)试剂

      (1)0.5 mol/L NaOH.

      (2)斐林-酚试剂甲液:由A.B两种溶液组成:

       A液:4%碳酸钠(Na₂CO₃)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液等体积混合;

       B液:1%硫酸铜(CuSO₄•5H₂O)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等休积混合。使用前将A与B按50:1的比例混合即成,此试剂只能在使用当天配制。

      (3)斐林一酚试剂乙液:称取钨酸钠(Na₂WO₄•2H₂0)100g,钥酸钠(Na₂MoO₄ •2H₂O)25g,加蒸馏水700mL溶解于1500mL的圆底烧瓶中。之后加人85%的H₃PO₄50mL,浓HCl 100 mL,安上回流装置(使用磨口接头,若用软木塞或橡皮塞时,就必须用锡铂纸包起来),使其慢慢沸腾10h。冷却后加人硫酸锂(Li₂SO₄•H₂O)150 g,蒸馏水50mL,溴水2-3滴,打开瓶口煮沸15 min,以逐出过量的溴,冷却后溶液呈黄色(若仍呈绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min)。待冷却后稀释至1 000 mL,过滤入棕色瓶中保存、使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。因此在使用前应进行标定。标定方法:取5ml.福林-酚试剂乙液放人锥形瓶内,用1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定,酚酞作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时,即为滴定终点。计算其相当的酸度,用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于1 mol/L 的酸度。

      在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此实验的反应只在pH≠10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度威弱。

      (4)标准蛋白质溶液:称取25 mg牛血清蛋白,溶于100 mL蒸馏水中，使终:浓度为250 1ug/mL。

斐林-酚试剂法实验步骤：

(一)标准曲线的绘制

      (1)取18 mmx 200 mm试管7支,1-7编号,分别加人0 mL、0.1 mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL标准蛋白质溶液，用蒸馆水补足1mL,使每管含蛋白量分别为0 ug/mL、25 ug/mL 、50 1g/ml、100ug/mL、150ug/ mL、200ug/mL、250ug/mL。

      (2)用定量加样器给每支试管中加入5 mL甲液,混匀，于30℃下放置10 min。

      (3)再向试管中喷射加人0.5mL乙液，立即振荡混匀,在30℃下准确保温;30 min。

      (4)以不加标准蛋白的1号管为空白,在650nm下用1cm光径的比色m测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

(二)样品的测定

      样品的提取:称取鲜样0.5 g,用5 mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10 000 r/min离心10 min ,取上清液1.0 mL(视蛋白质含量适当稀释)于试管中，然后重复标准曲线绘制中的2-4步骤,以空白管调零.测定吸光度。根据吸光度查标准曲线,求出样品中的蛋白质含量。

结果计算

      式中:C为查标准曲线值,ug; V_T为提取液总体积,mL; W_F为样品鲜重,g;V_S为测定时加样量,mL。

注意事项

      还原物质,其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。