蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，又是碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。本文将会介绍蔗糖合成酶（SS）与蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性测定的原理、实验方法以及注意事项。

原理：

      蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖供体UDPG反应生成蔗糖。

      这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。该酶在分解方向的Km值相对较高（30-150 mmol·L^-1-1），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UDP，测定果糖含量表示酶活性）。

      蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖：

      6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。实际上最近有证据表明SPS和SPP可以在体内形成一复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。

      一般把SPS-SPP系统看做是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。

      果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。

试剂

(1).提取缓冲液：100 mmol·L^-1 Tris-HCl（pH7.0）缓冲液，内含5 mmol·L^-1 MgCl₂，2 mmol·L^-1 EDTA-Na₂，2%乙二醇，0.2%牛血清清蛋白（BSA），2% PVP，5 mmol·L^-1 DTT。
(2).透析缓冲液：25 mmol·L^-1 Tris-HCl（pH7.0）缓冲液，内含2.5 mmol·L^-1 MgCl₂，1 mmol·L^-1 EDTA-Na₂，1%乙二醇，1 mmol·L^-1 DTT。
(3).酶反应液：100 mmol·L^-1 Tris-MES（pH7.0）缓冲液，内含10 mmol·L^-1果糖（F6P）5 mmol·L^-1 醋酸镁，5 mmol·L^-1 DTT。
(4).10 mmol·L^-1 UDPG:称取0.012206g UDPG，配成2 mL，浓度即为10 mol·L^-1 UDPG，随配随用。
(5).2mol·L^-1 NaOH。
(6).30%HCl。
(7).0.1%间苯二酚：0.1g间苯二酚溶于100mL 95%乙醇中，棕色瓶保存。
(8).1 mg·mL^-1蔗糖标准液。

方法步骤：

(1).酶液制备：称取1g预先剥粒备用额小麦籽粒，置于预冷的研钵中，分批加入5mL提取缓冲液，冰浴研磨提取，2℃下10000g离心20 min，上清液3 mL装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液中4℃透析过夜，其间更换透析液3次，透析后酶液定容5mL备用。
(2).蔗糖合成酶活性测定：取3支10mL具塞试管，加入0.4mL酶反应液，0.1mL UDPG和0.05mL透析后的酶液，补水至1mL，于30℃水浴中反应10min后，沸水浴3min中止反应。对照用蒸馏水代替UDPG。
(3).蔗糖含量测定：往各反应试管中加入2 mol·L^-1 NaOH 0.1mL，沸水浴10min后，冷却至室温。加30%HCl 3.5mL，0.1%间苯二酚1mL，摇匀后于80℃保温10min，冷却后480nm处比色，测定蔗糖生成的量。
(4).蔗糖磷酸合成酶反应：在酶反应液中用10mol·L^-1果糖-6-磷酸代替果糖，其余均按蔗糖合成酶的方法测定。
(5).标准曲线制作：取7支10mL具塞试管，并按下表加入各种试剂，按上述步骤3反应并测定其吸光度。以吸光度值为纵坐标，蔗糖含量为横坐标，绘制标准曲线，以计算反应中蔗糖形成的数量。

试剂	试管号
	1	2	3	4	5	6	7
1 mg·mL-1蔗糖标准液/mL	0	0.1	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
蒸馏水/mL	1.0	0.9	0.8	0.6	0.4	0.2	0
蔗糖含量/mg	0	0.1	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
A480

(6).结果计算：蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活力单位均为mg蔗糖·g^-1FW·h^-1。

式中，C：从标准曲线查得的蔗糖量（mg）；FW：样品鲜重（g）；t：反应时间（h）：Vt：提取酶液总体积（mL）；Vs：测定时取用酶液体积（mL）;n：提取液测定中的稀释倍数。

注意事项：

透析袋不可装满，以防止吸水胀破。