薄层层析(thin- layer chromatography, TLC)法操作容易、设备简单、分离效率高。而且层析展开时间短,只需要几分钟到几小时,即可获得结果;同时又可使用腐蚀性的显色剂,并能在高温下显色。已经广泛应用于植物激素、氨基酸、核苷酸、有机酸和糖脂等有机化合物的分离纯化。

1.原理

    TLC分离样品的主要原理包括吸附、分配和离子交换等作用。植物激素的分离纯化常采用吸附薄层层析。当样品组分在吸附薄层板上进行分离时,由于样品极性差异,不同组分与吸附剂和展层剂的亲和力强弱不同，从而导致各个组分在薄层板上的移动距离不同，于是样品中的各个组分彼此得到分离。

2.仪器设备

1. 20cm X 8cm的玻璃板:2块。	2.烘箱:1台。
3.紫外灯:1个。	4.100μL微量进样器(或定量毛细管):1支。
5.层析缸:1个。	6.小研钵:1个。
7.2mL、5mL移液管:各1支。	8.50mL量筒:1个。

3.试剂

1.硅胶GF。
2.0.4%聚乙烯醇。
3.95%乙醇。
4.离心机。
4.各种激素标准样:浓度为1 mg•mL^-1的IAA、ABA和GA₃用甲醇或95%乙醇溶解，CTK的标准样可选用异戊烯腺嘌呤或玉米素,用2mol•L^-1HCl或NaOH溶解。
5.展开剂:异丙醇:氨水:蒸馏水=10:1:1或正丁醇:异丙醇:氨水:蒸馏水=2:8:1: 1,体积比。
6.pH5.4的柠檬酸-磷酸缓冲液。

4.方法步骤

    TLC操作过程包括制板、点样、展层、显色、定位检测、洗脱和进一步的定量分析等步骤。

     1.制板:称取硅胶GF5 g,加入0. 4%聚乙烯醇2 mL,在小烧杯中搅拌至变成黏稠状时,开始铺板,一般可制20 cmX8 cm的玻璃4~5块。制好的薄层板在室温下晾干,用前在110 C烘箱中活化30 min。

    2.点样:取两块薄层板,在第一块板上准备点含有IAA、ABA和GA的甲醇溶解液,第二块板点含有CTK的乙醇溶解液。其操作方法:用微量注射器吸取100 μL样液,分3-4次点在距薄板边缘1 cm的位置上,样点直径要求不超过3 mm,各点之间的距离1-1.5 cm。点完待测样后，再分别点上IAA、GA₃和ABA三个标准样。第二块板的操作完全相同,只是标准样用CTK。

    3.展层:将点样后的薄层板架放在盛有展开剂的层析缸中,先不与展开剂接触,加盖后饱和1 h,再将薄层板的点样端浸人展开剂中3~4 mm,当展开剂前沿距顶端1 cm左右时,停止展层。

    4.定位检测:展层完毕后,微风吹干,并在紫外灯下观察色斑，根据标准样点的位置来确定未知样点中各内源激素的位置,并用铅笔圈出范围进行定位。注意应尽量缩短在紫外灯下观察的时间,避免样品分解。

    5.洗脱:将含有激素色斑的硅胶分别刮下,用95%乙醇浸提(洗脱)3次,每次1 h,合并浸提液,N2吹干或减压蒸干后,用pH 5.4的柠檬酸-磷酸缓冲液溶解、定容,供进一步定量检测之用。

    6.定量:用pH 5.4的柠檬酸-磷酸缓冲液溶解、定容后可采用气相色谱、酶联免疫吸附检测或其他方法进行定量分析。

 

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